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主题 : 论坛精彩论文选刊(十九)
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0  发表于: 2015-08-13  

论坛精彩论文选刊(十九)

养血清脑颗粒对SHR大鼠左心室
基因表达谱的影响
                              布里斯本     郭志君 
基因芯片技术其具有高通量、大规模、可平行性分析,适用性强,应用范围广,信息处理的空间大特点,对于解析中药方剂多组分、多靶点的整合调节作用研究,提供了一个前所未有的先进高通量快速筛选方法,是既往一个一个基因寻找中药的靶点远远不能比拟的。由于中药多组分的特点,其发挥作用必然是一大批基因相互协调起作用,所以通过研究药物对基因谱表达的影响,采用生物信息处理方法,可能能够部分阐明方剂配伍后治疗疾病的分子机制。
本实验在明确养血清脑颗粒降压及减轻左心室肥厚的基础上,进一步采用基因芯片技术研究养血清脑颗粒对SHR左心室相关基因表达的影响,探讨该药对减轻心室肥厚的机制。
材料与方法
1. 实验动物:同实验一
2.  试剂:TRIzol、异丙醇、氯仿、75 % 乙醇(RNase-free)、Milli-Q水(RNase-free)无水乙醇、dNTPs、Cy5-dCTP和Cy3-dCTP、杂交试剂1、标记试剂I、杂交试剂2、标记试剂II、反转录酶、标记试剂III、反转录引物 、洗片试剂1、反转录酶、缓冲液、洗片试剂2 、DTT、 洗片试剂3,大鼠4000点cDNA芯片(R40s)。上述试剂均由上海博星基因芯片有限责任公司提供
3.仪器与设备:电动玻璃匀浆机、电子天平 、低温高速离心机 、低温高速台式离心机、超净工作台 、制冰机、电热恒温水槽、电泳槽、电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、台式离心机、核酸定量分析仪、移液枪、可调电炉、旋涡混合器、杂交箱、杂交舱、S-200纯化柱、真空浓缩仪、盖玻片、ScanArry4000芯片扫描仪
4.实验方法
(1)分组及给药:同实验一,但此实验中仅观察SHR模型组和养血清脑高剂量组。选取灌服养血清脑颗粒8周SHR以及同期饲养的SHR各10只,称体重,处死大鼠,开胸迅速取出心脏,用DEPC处理过的生理盐水冲洗,洗净残血,在左心室心尖部位剪取约100mg心肌组织,迅速放入冻存管中,投入液氮中保存(组织剪取在冰上进行;整个过程所用器械、锡纸、烧杯等均用0.1 %DEPC溶液处理,高温消毒或烤箱中烘烤消毒)。各组中每5只心尖组织等量混合作为1个样品,药物组2个样品,模型组2个样品,分别进行总RNA提取。
(2)总RNA提取
将超低温保存的样品称重后,转移至用液氮预冷的碾钵中,用杵子碾磨组织,其间不断加入液氮,直至碾磨成粉末状,转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中,置于冰浴中,进行匀浆。将匀浆液转移至15 mL离心管中, 于4℃,12000 g,离心10 min。吸取上清液转入新的15 mL离心管,在15-30℃放置5 min。向匀浆液中加入氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管,在15-30℃放置3 min。于4℃,12000 g,离心15 min。 从离心机中小心地取出离心管,吸取上清至另一15 mL离心管。 向上清加入异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,在15-30℃放置10 min。于4℃,12000 g,离心10 min。弃去上清,缓慢地沿管壁加入75 %乙醇5 mL,轻轻颠倒洗涤离心管管壁,小心弃去乙醇。再加入75 %乙醇10 mL,在涡旋器上短暂涡旋;于4℃,8000 g离心10 min。小心弃上清,短暂离心,用移液枪吸去所有上清,在超净工作台中干燥沉淀5 min。加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后,-80℃保存。
(3) 探针标记与杂交
配制预杂交液:杂交试剂1加入到的Eppenderf管中,振荡混匀后,加入杂交试剂2混匀。将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2 min,将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30 sec,玻片取出后即放入无水乙醇中30 sec,晾干。将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内,盖上盖玻片,放入杂交箱内42℃预杂交5~6 h。
标记探针:Cy5-dCTP标记养血清脑颗粒药物组,Cy3-dCTP标记SHR模型组。(以下在冰浴中进行)于一已灭菌的1.5 mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50 μL,以下试剂均为RNase-free): ddH2O, 23 μL;逆转录引物,5 μL;总RNA,50~100 μg
振荡混匀,置于70℃水浴10 min。取出后,迅速置于冰上。分别加入以下试剂:逆转录酶缓冲液,10 μL;DTT,5 μL;dNTPs,4 μL。而后在暗室中加入以下试剂:逆转录酶,2 μL;Cy5-dCTP或Cy3-dCTP,3 μL。
用手指弹打管壁以混匀样品,手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2 h。依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4 μL,65℃水浴10 min后加入标记试剂II 4 μL。混匀,合并对照组、实验组。避光,真空抽干至50 μL左右。使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA。将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀,悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈,掰断柱下端的密封头。将柱置于一个1.5 mL的Eppendorf管中,以3000 rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5 mL Eppendorf管中,去掉顶端的帽,将样品慢慢加到树脂上表面的中间,注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min,经纯化的样品流出,被收集在支持用的Eppendorf管中。加入标记试剂III 8 μL,真空抽干。
杂交:在抽干的探针管中加6.5 μL杂交试剂I,充分混匀,使探针溶解。再加入6.5 μL杂交试剂II,混匀备用。将预杂交的玻片取出,用ddH2O冲去盖玻片。将探针置于95℃水浴中变性2 min;玻片置于95℃水浴中变性30 sec,玻片取出浸无水乙醇30 sec,探针取出后迅速置于冰上。将探针置于芯片上,用盖玻片覆盖,置于杂交舱中,用Parafilm密封,放入42℃杂交箱内杂交过夜(16~18 h)。
洗片:用0.5 %的洗涤液1冲洗玻片,去除盖玻片。准备两个染色缸,分别装有0.5 %的洗片试剂1+2 %的洗片试剂2、5 %的洗片试剂3,放入60℃水浴锅中。 将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10 min。用0.5%的洗涤液1冲洗玻片,晾干后扫描。
(4)检测与分析:基因芯片由General Scanning公司生产的ScanArray4000扫描仪进行两个波长的激光扫描,再用ImaGene3.0软件分析cy3、cy5两种荧光信号强度和比值。 将所有数据项的cy3标记强度乘上Normalize系数,得出调整后的cy3*。算出所有基因调整后的Ratio值(cy5/cy3*)。 筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据,Ratio>2说明此基因在养血清脑组中呈高表达,Ratio<0.5说明此基因在养血清脑组中为低表达。

结    果
1. 差异表达的基因表达谱:扫描图谱的基因表达谱,X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值和 cy5荧光强度值为坐标,每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号,愈靠近X轴或Y轴表明该点基因差异表达愈显著。数据点若为红色,则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间,基本属非差异表达;数据点若为黄色,则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外(该点很可能属于表达差异)。












 
图3  双色荧光标记叠加图               图4  杂交信号强度散点图



2. 差异表达的基因数:两张芯片阳性基因重叠有20条,其中高表达的基因有4条,低表达的有16条。未知基因有14条,已知基因有6条见下表。

          基因名称                                    Ratio1  Ratio2  
Glycine methyltransferase (Gnmt)                               0.353   0.132

LTBP-2 like protein (Ltbp2)              0.451   0.212

beta-galactoside-alpha 2,6-sialyltransferase     0.485   0.437

CD36 antigen                                             2.251   2.743

heart fatty acid binding protein (Fabp3)                     2.002   3.610

Propionyl Coenzyme A carboxylase, beta polypeptide (Pccb)  2.010 2.174




小 结
养血清脑颗粒是通过上调和下调多种基因协同发挥作用。其改善和减轻LVH和MF的机制可能与LTBP-2基因表达下调有关。Gnmt是体内的一种生物酶,是调节体内甲基代谢的关键蛋白质,其表达下调对于保证以S-腺苷甲硫氨酸为主的体内甲基集团的供给具有重要作用。 CD36 、Fabp3 、Pccb都是体内重要的活性物质,在调节心脏脂肪酸、胆固醇等物质的代谢,保护心肌细胞,防止动脉粥样硬化方面都有积极意义。
主要参考文献
[1] Snith JFM,Cleutjens,JPM,van Kripen,et al:Cardiac remodeling in hypertension and following myocardial infrarction:effects of arteriolar vasodilators[J] BasicRes Cardial 1991;86(suppll);134-139
[2] Weber KT,Brilla CG:Pathology hypertrophy and cardiac interstitium[J] Circulation  1991;83(6):1843-1865
[3] Xie Liang-Di, Chen Da-Guang, Zhang Sheng, et. Al. Effects of various doses of captopril on left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertension rats. Chin J Phar Toxi, 1995,9(1):12-15 
[4] Ferder L, Inserra F, Romano L, et al. Converting enzyme inhibition modulates sympathetic neuro-transmission invivo via multiple mechanisms. Am J Physiol,1993,264(4 pt1):E7

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